載玻片
載玻片厚度應在0．8～L 2mm之間，太厚的玻片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚焦。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英載玻片。
蓋玻片
蓋玻片厚度在o．17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光又可激發標本。
標本
組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發。另外，細胞重疊或雜質掩蓋、背景非特異染色引起的熒光影響判斷。
鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，使用特制的無熒光鏡油，也可用甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響
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